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海南FabDELLOIdeS蛋白酶IgG特异性蛋白酶

来源: 发布时间:2024年10月11日

Genovis提供FabRICATOR(IdeS)验证包。三种不同批次的冻干酶,用于验证基于FabRICATOR的分析方法。FabRICATOR(IdeS)是一种IgG特异性半胱氨酸蛋白酶,可消化铰链下方单个氨基酸位点的抗体,产生均质的F(ab')2和Fc片段。FabRICATOR酶已成为生物制药行业中使用的工具,用于表征用于zhiliao用途的单克隆抗体、Fc融合蛋白、ADC和生物仿制药。每批FabRICATOR酶在释放前都经过严格的酶活性、特性和纯度测试。FabRICATOR验证试剂盒由三批冻干酶组成,使方法验证更容易。每批都附有一份分析证书。QC应用的简化方法验证;批次间变异性评估的理想形式;提高批量放行检测性能的可信度。如Thermo Scientific™ KingFisher™ ;在振动台上也能同样出色地工作。海南FabDELLOIdeS蛋白酶IgG特异性蛋白酶

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对于涉及完整Fab或Fc抗体片段的应用,需要在抗体铰链处进行消化。木瓜蛋白酶和 Lys-C 等传统酶可用于生成 Fab 片段,但非特异性酶活性需要仔细优化,以极大限度地降低多个消化位点的风险。Genovis的SmartEnzymes IgG 蛋白酶 GingisKHAN 和 FabALACTICA 具有一个消化位点,可从人 IgG1 生成均质的 Fab 和 Fc 抗体片段。生成的片段可用于结晶和高阶结构 (HOS) 的 NMR 研究、结合研究等。在这里,我们提出了获得完整Fab和Fc抗体片段的不同策略。所得片段显示 GingisKHAN 的有效消化,用于生成完整的 Fab 片段或从依那西普上的融合 TNFR 结构域中分离 Fc。由于 GingisKHAN 的特异性消化依赖于 IgG 的天然折叠,因此在变性条件下特异性受到负面影响。为了使用SDS-PAGE分析消解效率,在加入SDS上样缓冲液之前,停止在分析样品中加入碘乙酰胺的反应。Genovis同时提供IdeS酶的纯化试剂盒。黑龙江FabRICATOR ZIdeS蛋白酶蛋白组学可使用FabULOUS 和 FabULOUS Fab 试剂盒可用于制备 Fab 片段。

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与IdeS不同,为了获得更均匀的度拉糖肽融合蛋白的消化产物,用Genovis的GlySERIAS固定化蛋白质消化该蛋白质,该蛋白由与琼脂糖珠共价偶联的GlySERIAS酶组成。通过将酶偶联到树脂上,可以增加酶与蛋白质的比率,从而可以进一步加速反应,以获得更完整的连接子消化。此外,该酶不会存在于样品制备中,可能会干扰样品分析。为了进行比较,度拉糖肽在37°C下用GlySERIAS固定化过夜,或用GlySERIAS冻干1小时并在37°C下过夜消化。 为了降低样品复杂性,使用内切糖苷酶GlycINATOR冻干去除Fc聚糖,并减少链间二硫键。通过反相LC-MS对样品的分析表明,GlySERIAS Immobilized几乎完全消化了Fc结构域中的连接子,留下了接近均质的Fc/2产物,其中含有来自连接子的一个丝氨酸残基。用 GlySERIAS 冻干 1 小时或过夜消化,两者都会产生几种 Fc 产物,并附着不同数量的丝氨酸和甘氨酸残基。GLP-1肽在所有三个样品中以两种变体存在。使用GlySERIAS固定化消化的均质Fc/2能够详细研究特定于Fc区域的质量属性。此外,在样品中未观察到干扰分析的酶峰。作为补充,Fc/2 产物在用 GlySERIAS 冻干消化后残留部分连接子,有助于研究位于 GS 连接子的修饰。

大多数zhiliao性抗体都携带人IgG1骨架,双特异性和多特异性形式的开发正在迅速增加。此类抗体的分析需要特异性酶来表征特性,例如单价结合、二硫键扰乱和配对Fc糖基化。传统方案包括使用木瓜蛋白酶和Lys-C的酶消化,这需要优化以极大限度地减少过度消化并获得足够的产量。Genovis的FabDELLO与IdeS酶具有不同的特异性,它在铰链上方的单个位点消化人IgG1,并产生完整的Fab和Fc片段。为了证明FabDELLO的特异性活性,通过非还原SDS-PAGE消化和分析了IgG1和Fc融合蛋白的选择。所有底物均实现了完全消化,包括具有其他困难的LALA和LFLE突变的IgG1。FabDELLO酶在底物上的精确和有效性能验证了其在生物制药开发中的用途。但要在亲和步骤中捕获 Fc 片段,您需要另一种填料。

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与IdeS不同,Genovis的GingisREX(RgpB)是一种精氨酸特异性蛋白酶,可消化精氨酸残基的C末端蛋白质,包括难以与其他酶消化的Arg-Pro键。该酶可用于肽图分析、从头肽测序和翻译后修饰分析。精氨酸残基的特异性C-末端消化;在其他困难的精氨酸-脯氨酸序列中可靠消化;产生更长的肽-提高序列覆盖率。GingisREX是一种半胱氨酸蛋白酶,可特异性地消化肽键C末端到精氨酸残基,包括与脯氨酸相连的精氨酸。半胱氨酸是酶活性所必需的。与胰蛋白酶消化相比,可生成更长的肽,胰蛋白酶消化可以通过高分辨率质谱进行分离和鉴定。这为自下而上方法的样品制备提供了更多选择,以实现替代的酶解曲线和更高的序列覆盖率。GingisREX在赖氨酸上没有活性,通常使用Arg-C观察到。该酶在5.0-9.0的宽pH值范围内具有活性,它需要半胱氨酸并被盐酸胍抑制。该酶是从牙龈卟啉单胞菌中纯化的。Genovis的内切糖苷酶 IgGZERO和 GlycINATOR 还可以研究完整的 ADC,但降低复杂性并提高分辨率。辽宁FabRICATORIdeS蛋白酶IgG特异性蛋白酶

Blinatumomab(一种对 CD19 和 T 细胞标志物 CD3 具有特异性的 BiTE 分子)。海南FabDELLOIdeS蛋白酶IgG特异性蛋白酶

Genovis的FabRICATOR MagIC自动样品制备可用于分析和监测不同的CQA。mAb在生产或储存过程中的氧化就是这样一种CQA,可能会影响zhiliao产品的质量。为了展示FabRICATOR MagIC如何解决这个问题,对6种mAb的混合物进行强制降解(室温下3个月),并通过反相LC-MS进行分析。当在完整水平上分析mAb时,可以检测到mAb5丰度的显着差异,同时出现许多新的峰。然而,无法获得可靠的质量数据。使用FabRICATOR MagIC,mAb5变化的来源在Fab区域内。随后还原为 Fc/2、LC 和 Fd' 片段,可以识别差异是由于 mAb5 Fd' 片段上的色氨酸氧化,通过形成氧代内酯 (+14 Da) 和二氧代内酯 (+30 Da) 以及 mAb5 LC (-18 Da) 的琥珀酰亚胺化来揭示。此外,还可检测到mAb3轻链的异构化。该示例说明了FabRICATOR MagIC在mAb中级分析中的强大功能,它创建的片段足够小,可以精确定位特定的修饰,而无需耗时耗费资源的肽图分析,所有这些都以相对较少的手动操作时间快速完成。海南FabDELLOIdeS蛋白酶IgG特异性蛋白酶