双光子显微镜在各领域研究中已有许多成功实例;生物领域:贝尔实验室的Svoboda等人研究了大脑皮层神经元细胞内钙离子动力学情形。利用双光子显微镜观察到的现象证明了钙离子的增加依赖于肌体触发的钠离子作用电势。信息领域:美国科学家Rentzepis提出了一种在现有二维光盘的基础上将数据储存扩展到三维空间。由于双光子激发具有作用精细体积小的特点,避免了层与层之间的互相干扰,较大地提高了数据储存密度。双光子显微镜已延伸到各个领域研究中,它能对样品进行三维观察,其基础双光子激发效应也具有极高的应用价值。我们可以相信,随着科技不断发展,其他技术的不断结合,双光子显微镜将得到更大的发展与更广的应用。这种双光子显微镜的视场是普通显微镜的10倍。美国bruker双光子显微镜商家
双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是:在高光子密度的情况下,荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子,在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后,发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双(多)光子成像优势在于,具有更深的组织穿透深度,利用红外光,能够在层面检测极限达1mm的组织区域;因信号背景比高,而具有更高的对比度;因激发体积小,具有定点激发的特性,具有更少的光毒性;激发波长由紫外、可见光调整为红外激发,使其能够更加安全。美国双光子显微镜商家电话双光子显微镜将得到更大的发展与更广的应用。
生物样品的三维观察是了解细胞功能的重要方法之一。目前已有的三维荧光成像技术有光学显微镜、点阵照明和激光扫描显微镜(如共焦显微镜和双光子显微镜)。其中,激光扫描显微镜利用转盘可以进行多焦点激光扫描,提高了时间分辨率,有利于减少活细胞成像中的光损伤。本文主要实现可见光双光子激发和多焦点激光扫描的结合,**终提高三维延迟扫描中的空间分辨率和成像对比度,这也是可见光双光子激发(v2PE)在超高分辨率显微镜中的应用。
新一代微型化双光子荧光显微镜体积小,重只2.2克,适于佩戴在小动物头部颅窗上,实时记录数十个神经元、上千个神经突触的动态信号。在大型动物上,还可望实现多探头佩戴、多颅窗不同脑区的长时程观测。相比单光子激发,双光子激发具有良好的光学断层、更深的生物组织穿透等优势,其横向分辨率达到0.65μm,成像质量与商品化大型台式双光子荧光显微镜可相媲美,远优于目前领域内主导的、美国脑科学计划重要团队所研发的微型化宽场显微镜。采用双轴对称高速微机电系统转镜扫描技术,成像帧频已达40Hz(256*256像素),同时具备多区域随机扫描和每秒1万线的线扫描能力。此外,采用自主设计可传导920nm飞秒激光的光子晶体光纤,该系统实现了微型双光子显微镜对脑科学领域较广泛应用的指示神经元活动的荧光探针(如GCaMP6)的有效利用。同时采用柔性光纤束进行荧光信号的接收,解决了动物的活动和行为由于荧光传输光缆拖拽而受到干扰的难题。未来,与光遗传学技术的结合,可望在结构与功能成像的同时,精细地操控神经元和神经回路的活动。于双光子激发需要两个光子同时到达,因此只有在焦点附近的样品区域才会激发,从而实现三维成像和高分辨率。
其实电子显微镜相比于光学显微镜的重要优势或者存在的比较大意义,准确的来说,不在于放大倍数,而在于超高的分辨率。这两者是不同的。通俗的来说,就是进行观察的时候,除了要将物体放大,还需要能将它与相邻的其他物体分辨开来。如果两个相邻微粒的图像在光学显微镜下,即使放大到很大,看到的可能却是两个相交的亮斑(艾里斑),而没有明显的界限(更不用说细节了),这表示是分辨率不够。抛开分辨率谈放大倍数是没有意义的。光学显微镜的分辨率极限是阿贝极限,约等于光波波长的一半,通常被说成是光学显微镜放大极限,其实准确地来说,应该叫做分辨率的极限。而其产生的原因是光的衍射,根本原因是光的波粒二象性。电子衍射实验证明了电子的波动性,于是用电子代替光的电子显微镜成为可能。电子显微镜也有多种,题主说的是像REM的。电镜也存在用衍射规则观察的,比如低能电子衍射(LEED)和透射电镜(TEM)。两者主要用于观察晶体,根据其周期性的特点而生成倒易空间里的衍射图像,借助elward球或者傅里叶变换就可以转换到实空间,得到真正的晶体表面图像了。 双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。美国bruker双光子显微镜商家
双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为光源。美国bruker双光子显微镜商家
双光子显微成像技术不是什么新技术,早在20多年前就有了,目前已经在生命科学和材料科学中广泛应用。几年前双光子**过期后,已经推出自己的双光子显微镜的厂家估计不少于10家以上。即便如此,世界上很多实验室都搭双光子,自己搭的好处有很多,首先是便宜,尤其是实验室已经有飞秒激光器,那就更很省钱了。其次是灵活,可以选择针对特殊用途的搭配,改动也灵活。结束后的好处就是可以锻炼队伍,一趟走下来可以把新手带出来,后期维护也更加自由。当然坏处也不少,首先是操心,特别是第1次搭的时候,开始要想方案,后来要解决各种实际问题。其次是花时间,加上买配件的时间,比买一台现成的商业化双光子耗时长。现在已经有不少关于如何搭双光子显微镜的文章,各种protocol,大多是老外写的,中文的较少。其实完全自己搭一套好用的系统还是不容易的,尤其是没有经验的时候,容易走弯路,多花钱,也多花时间,再加上双光子的重要器件都需要从国外购买,在国内买这些东西耗时较长。因此,我想总结一下我们的经验,贴出来分享,希望能帮到想自己动手的实验室美国bruker双光子显微镜商家