一、体外生物发光试验荧光素试剂的制备：D-荧光素，钾盐，无菌纯水，完全培养基（自行配置）1、用无菌水制备100X荧光素原液（15mg/ml），轻轻颠倒摇动至荧光素完全溶解。混匀后立即使用或分装后-20℃冻存。2、将D-luciferin，potassiumsalt溶解于预热好的组织培养基中制备成浓度为150μg/ml的工作液。用组织培养基1∶100稀释储存液，配置工作液(终浓度150μg/mL)3、去除培养细胞的培养基图像分析前，向细胞培养板中添加1×荧光素工作液，然后进行图像分析-注射器滤膜过滤除菌，0.2μm注：成像前在37℃下对细胞进行短时间孵育可增强信号。小动物成像荧光染料能够选择性地与目标细胞或组织结合。免疫荧光荧光染料APC
如何选择的染料？
考虑到荧光染料种类繁多，您如何为您的特定应用选择使用哪种染料？以下是您需要考虑的一些因素。※与实验设计的兼容性：虽然它们可能与其他荧光团共享一些光谱相似性，但每种染料都是***的，并且具有不同的功能、激发和发射波长、波段形状和宽度以及光稳定性。为确保成功，请选择与您的实验设计相辅相成的一种。与设备的兼容性：选择与您正在使用的照明源相匹配的染料。在选择合适的荧光仪器时，请考虑仪器的灵敏度、动态范围、稳定性和通量、信噪比和信空白比。为了获得更好的结果，请确保染料的发射曲线与可用的检测方法相匹配。与样品中其他荧光材料的相容性：在双重或三重标记实验中，您选择的染料的发射和激发曲线不应与其他荧光团重叠。由于许多天然存在的细胞成分会以与您选择的染料或探针相同的波长发出荧光，因此您还需要确保可以从背景自发荧光中清楚地识别所选染料产生的信号。 四川化合物荧光染料DiD、DiR、DiO和DiI染料是最常见的细胞膜染料，它们是一族亲脂性的荧光染料，用于细胞的形态学和结构研究。
三：贴壁细胞染色1、将贴壁细胞培养于无菌盖玻片上。2、从培养基中移走盖玻片，吸走过量培养液，但要使表面保持湿润。3、在盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。4、37℃孵育细胞2~20min，不同的细胞比较好培养时间不同。可以20min作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记效果。5、吸干染料工作液，用培养液洗盖玻片2~3次，每次用预温的培养基覆盖所有细胞，孵育5~10min，然后吸干培养基。但要使表面保持湿润。四：结果检测样品可在培养基中进行检测，可通过荧光显微镜成像或流式细胞仪分析。
过标记——计算结果显示每摩尔145,000MW的蛋白标记的荧光团大于10mol。虽然过标记的蛋白也可以使用，但可能会引起蛋白的聚集、降低抗体结合抗原的特异性，这些都会造成非特异性结合。过标记还会引起荧光淬灭。可以增加蛋白或减少反应时间。3．未结合染料难以去除——尽管大部分时候用分离柱可以较好的纯化蛋白偶联物，但仍可能会有痕量的游离染料留在偶联物溶液中，会使标记计算的值偏高。可用分离柱再次分离或透析去除。4．蛋白或蛋白偶联物无法洗脱——不要再加缓冲液，只需再次离心一次或几次。异硫氰酸荧光素含有一个异硫氰酸酯反应基团这有助于其对通常存在于生物分子中的动漫和巯基基团具有反应性。
纳米粒子纳米颗粒是指尺寸在1到100纳米之间的颗粒。由于它们的小尺寸，纳米粒子通常用于不同类型的细胞和组织的荧光成像。当今生物成像中常用的一些纳米材料包括碳点、贵金属纳米颗粒、聚合物点、量子点和荧光掺杂二氧化硅等。在成像中，与其他分子荧光团和探针相比，纳米颗粒/纳米材料具有多种优势，使其成为理想的选择。除了提高亮度外，纳米粒子是惰性的并且往往分布均匀，这有助于在成像过程中获得更好的结果。此外，与各种分子荧光团相比，纳米颗粒和纳米材料没有细胞毒性，并且不受非特异性结合问题的影响。由于这些特性，大多数荧光纳米颗粒（染色纳米颗粒）可以内化到细胞/组织中，并容易靶向给定部位。D-荧光素钾盐是荧光素酶的水溶性底物，存在于多种发光生物体中。四川化合物荧光染料
DiR的红外荧光可以穿透细胞和组织，在小动物成像中用来示踪。免疫荧光荧光染料APC
一种发光杂环化合物，存在于生物发光的生物体中，如萤火虫。在含有三磷酸腺苷的情况下，通过荧光素酶氧化脱羧产生光。可用于荧光素酶生物发光成像和细胞高通量筛选应用。D-荧光素（D-Luciferin）是萤火荧光素酶底物，其量子效率为0.88，是Luminol的20倍。反应原理：首先，在镁离子存在下荧光素酶使荧光素与ATP反应，接着它被氧化形成二氧杂环丁烷结构并发出黄绿色的光。Luciferin-luciferase发光用于ATP监控以测定细胞活力以及细菌计数。它还用于报告基因检测。可与小动物***成像系统配套使用，用于标记LUC基因后的体内***荧光检测。D-荧光素游离酸（D-Luciferin,freeacid）、D-荧光素钾盐（D-Luciferin,potassiumsalt）和D-荧光素钠盐（D-Luciferin,sodiumsalt），钾盐、钠盐的形式是**通用的，因为它们都易溶于水。钾盐也是***动物检测使用的主要形式。它们的激发和发射波长分别为328nm和533nm。免疫荧光荧光染料APC